Метод полимеразной цепной реакции, или ПЦР, используется в лабораторной диагностике большинства инфекционных заболеваний. Он позволяет обнаружить в исследуемом материале генетический материал микроорганизмов и таким образом идентифицировать их.
Что это такое
Метод был разработан в 1983 году, а в 1993 году его автор – Мюллис – получил Нобелевскую премию.
Основы метода
Каждый вид микроорганизмов, растений или животных имеет уникальный набор хромосом. Они образованы ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислотой. Мелкие фрагменты ДНК называются нуклеотидами, а их определенная последовательность составляет ген. Каждый ген кодирует синтез одного белка, например, коллагена, альбумина и всех остальных. Последовательность нуклеотидов уникальна. Для каждого вида живых организмов существуют общие участки ДНК, отвечающие за однообразие в пределах этого вида.
Анализ ДНК нескольких сотен микробов, попавших в материал для исследования, не позволит выявить видовые закономерности. Необходимо во много раз увеличить количество значимых генетических компонентов, что даст возможность их идентифицировать. Эту задачу и решает метод ПЦР.
Исследование относится к области молекулярной биологии. К ДНК микроба добавляются ДНК-полимераза и свободные нуклеотиды. Полимераза – фермент, обеспечивающий многочисленное копирование нужного участка из имеющихся нуклеотидов. Запускают процесс праймеры – короткие нити рибонуклеиновой кислоты (РНК), прикрепляющиеся к началу нужного гена.
Процесс анализа состоит из нескольких фаз, каждая из которых требует определенного времени и температурного режима. В течение нескольких часов из тысячной доли грамма ДНК бактерий получается нужное количество материала для анализа. Современная аппаратура дает возможность многократно копировать ДНК даже одной клетки, например, сперматозоида.
Ход исследования
Этапы анализа:
- взятие биологического материала (крови, мочи, влагалищных выделений, слюны и так далее) у пациента и доставка в лабораторию;
- разделение двух нитей ДНК, переплетение которых образует хромосому, и очищение их от посторонних примесей;
- удвоение нужного участка нити ДНК, в результате ее количество растет в геометрической прогрессии;
- обработка полученного материала растворами, вызывающими специфическое свечение полученных фрагментов ДНК, по этому окрашиванию распознают, какая бактерия или вирус были в источнике; для разделения фракций ДНК используют электрофорез.
Длительность анализа составляет 4-5 часов.
Преимущества метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция обладает такими преимуществами перед традиционными способами определения возбудителей инфекции:
- прямое определение генов микроорганизма, в отличие от выявления антител к нему при многих других способах идентификации;
- специфичность, то есть определение конкретного вида возбудителя;
- чувствительность: для диагностики бывает достаточно даже одной клетки микроорганизма; в целом требуемое количество возбудителя в 10 раз меньше, чем для других методов;
- универсальность биоматериала – исследуется не только кровь, но и клетки плотных тканей, соскобы с эпителия, слизистые выделения и любые другие среды, где может быть микроб;
- скорость получения результата в несколько раз выше, чем при использовании других методов;
- возможность распознавания хронических, вялотекущих и скрытых инфекций;
- дезинфекция взятого у больного материала и исключение заражения сотрудников лаборатории;
- полная автоматизация процесса исследования.
Недостатки анализа
Минусы ПЦР связаны в основном с ее технической сложностью:
- необходимо правильно выбрать последовательности РНК – праймеры, а также приготовить смесь нуклеотидов для синтеза ДНК;
- метод очень чувствителен, поэтому если в образце есть разные виды микробов, он может давать неверные результаты;
- нужно тщательно очищать анализируемый материал от примесей белков человека и лекарств, так как они снижают точность диагностики;
- требуется контрольное сравнение результатов с образцами, заведомо содержащими или не содержащими материал микроорганизмов, а также вообще не включающими ДНК для определения ошибок и загрязнений.
Ложноотрицательные результаты ПЦР вызваны нарушением техники анализа и изменениями в генетической последовательности любого из компонентов реакции. Встречаются и ложноположительные данные – при случайном совпадении нуклеотидов праймеров и других применяемых реактивов с одним из генов микроорганизма.
Выделение микроорганизма не всегда говорит о том, что именно он стал причиной болезни. При анализе ДНК человека существует еще одна проблема: генетическая основа большинства заболеваний до сих пор неизвестна, что пока делает невозможной диагностику неинфекционной патологии на микробиологическом уровне. Это направление медицинской генетики очень активно развивается.
Показания для ПЦР-исследования
Этот анализ используется в таких ситуациях:
- необходимость выявления и идентификации вирусов, бактерий, простейших при любых инфекционных заболеваниях, когда требуется точность диагностики;
- диагностика генетических заболеваний человека;
- идентификация личности путем сравнения с генетическим материалом известного происхождения;
- анализ тканей, полученных путем тонкоигольной биопсии, которые очень трудно исследовать другими методами;
- диагностика лейкозов и злокачественных опухолей;
- проведение экспериментов с приживляемостью эмбриональных стволовых клеток у животных (у людей применение таких клеток запрещено), а также выведение линий лабораторных мышей с заранее заданным генетическим заболеванием.
Перспективы применения ПЦР-реакции и ее разновидностей в медицине и биологии захватывают воображение – от испытания новых лекарств на генном уровне до создания трансгенных организмов с заданными свойствами. Работы в этом направлении ведутся в крупнейших лабораториях мира, что помогает совершенствовать метод ПЦР и на прикладном уровне, для диагностики инфекционных болезней человека.
В медицине ПЦР-метод обычно используется для диагностики и оценки эффективности лечения таких заболеваний:
- внутриклеточные инфекции, например, микоплазменная или хламидиоз;
- болезни, передающиеся при сексуальных контактах;
- туберкулез;
- вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция;
- инфекция Helicobacter pylori и многие другие.
Подготовка к исследованию
За 3 дня до выполнения исследования необходимо отказаться от употребления спиртных напитков. По назначению врача отменяются некоторые лекарственные препараты, например, антибиотики.
Правила подготовки при диагностике половых инфекций:
- за 2 дня до анализа прекратить половые контакты;
- за 2 часа до исследования не мочиться;
- накануне вечером и утром не спринцеваться; подмываться только теплой водой без моющих средств;
- не сдавать ПЦР во время менструации и в течение 4 дней после кольпоскопии (у женщин).
Общие правила подготовки:
- за 2 дня исключить интенсивные физические нагрузки, занятия спортом;
- с утра в день исследования не курить и не употреблять пищу;
- если материал будет браться из полости рта и носоглотки – утром не чистить зубы.
От выполнения этих простых правил зависит достоверность этого точного, но недешевого метода диагностики. Самостоятельная интерпретация результата не даст нужной информации о болезни и ее лечении. Вот поэтому после получения данных ПЦР-исследования необходимо обратиться к врачу.
К какому врачу обратиться
При подозрении на венерическое заболевание на ПЦР направляет гинеколог, уролог, андролог, венеролог. Исследование при гепатитах и ВИЧ-инфекции назначает инфекционист, при туберкулезе – фтизиатр. ПЦР в своей практике используют врачи многих специальностей, например, онкологи, гематологи, гастроэнтерологи, генетики.
Полезная информация о ПЦР-анализе:
Врач-венеролог, уролог Ленкин С. Г. рассказывает о ПЦР-анализе:
(Пока оценок нет)
Загрузка...